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英國Oxford Nanoimaging新一代超分辨熒光顯微鏡
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英國Oxford Nanoimaging公司生產的最新產品超分辨熒光顯微鏡-Nanoimager 是由牛津大學Achillefs Kapanidis教授團隊經過8年時間研發(fā)而成的，是一種新型的 單分子顯微鏡，也是世界上唯一一款無需校準、無需光學平臺、超小型臺式超分辨顯微鏡 。
Nanoimager突破了傳統(tǒng)光學的衍射極限，分辨率可達20nm，是全球第一臺大視野單分子FRET顯微鏡。Nanoimager簡單易用、設計緊湊，使用安全無害的一級激光，用戶在普通的實驗室桌面上即可獲得高分辨率的單分子熒光圖像 。適用于單分子示蹤、活細胞成像、蛋白互作、3D成像等研究。
Nanoimager技術特征超分辨率成像
♦ 支持同時雙色成像和順序四色成像♦ 高能量帶來高精度♦ 三維成像♦ 隨機光學重建顯微技術 (dSTORM)和光激活定位顯微技術 (PALM)
√ 無需光學平臺√ 使用前無需校準√ 操作簡單方便√ 便攜式，體積小√ 普通實驗桌即可安置√ 采用1級激光，使用安全
Nanoimager 顯微鏡設計♦ Nanoimager具有和傳統(tǒng)顯微鏡不同的特殊設計。傳統(tǒng)顯微鏡需要集成單分子檢測功能的配件，同時也會帶來配件的限制性，而Nanoimager是專門為單分子超分辨成像而設計，為了達到更高的效率而移除了多余的成像元件；
♦ 配置更加安全的一級激光,Nanoimager可在任何辦公室、實驗室和教室使用。相對于放置于暗室的大型顯微鏡， Nanoimager更加方便用戶的使用；
♦ Nanoimager的顯微鏡單位面積小于A4紙；配套的激光器通過光纖連接至顯微鏡；♦ 與定制的顯微鏡和傳統(tǒng)的顯微鏡設計不同， Nanoimager始終保持校準狀態(tài)。樣品準備好后可以直接成像，無需花費時間進行調試和校正。
♦ Nanoimager的封閉式系統(tǒng)能夠防止偏移發(fā)生并阻止灰塵和其他污染物進入，可以一直保持在正常工作狀態(tài)。作為一款臺式機， Nanoimager不需要傳統(tǒng)顯微鏡昂貴的配套設施，無需額外配置溫控房間、光學平臺、激光室或暗室。
Nanoimager 技術原理
Nanoimager采用PALM/dSTORM技術，利用單分子定位算法并結合光學系統(tǒng)艾里斑的形狀，以超高精度（納米量級）獲得熒光分子的中心位置，然后用CCD將其信號進行采集轉化最終得到分辨率為20nm的超分辨圖像。
成像模式
相對于普通的Epifluorescence(EPI)/模式，Nanoimager有total internal reflection fluorescence (TIRF)/ highly inclined and laminated optical sheet (HILO)兩種模式可自由切換。
EPI：激發(fā)較厚的樣品（＞10um），信號噪聲強，即傳統(tǒng)模式。
TRIF：激發(fā)薄層樣品（＜200nm），信號噪聲弱，適用于膜表面成像。
HILO：激發(fā)樣品厚度（＜10um），信號噪聲較弱，適用于大部分成像。
應用領域
單分子示蹤 單分子成像 蛋白質相互作用 
蛋白質組裝 表觀遺傳學 DNA納米定位 
單分子定位 單分子FRET 外泌體 應用案例1、單分子FRETNanoimager是世界第一臺用于大視野單分子熒光共振能量轉移(smFRET)的商業(yè)化儀器。 FRET是一種兩個熒光分子間非輻射性的能量轉移方式，反映兩者的分子間距。 FRET一般在2 – 10 nm的間距發(fā)生。 smFRET研究中，作為供體的熒光分子由激光激發(fā)，將能量轉移至臨近的受體熒光分子。被激發(fā)的受體將能量以熒光形式發(fā)散。供體與受體可以連接至同一個或者不同的分子。smFRET可以用于測量核酸或者單個蛋白分子的分子內距離，也可以用于研究蛋白亞基間的相互作用；還可應用于研究藥物對于酶結合位點的構象動力學的作用，或是神經退行性疾病中蛋白的聚集。 smFRET可以用于在單分子層面推到結合常數、反應途徑與停滯時間而不受總體平均值干擾。Nanoimager適用于smFRET的關鍵功能包括：同時雙色成像；單分子散射光強度和總體平均的實時分析；視野中數千個單分子的高通量成像，以及用交替熒光激發(fā) (ALEX) smFRET的功能來定量化學計量與FRET效率。圖4是smFRET用于研究單個DNA霍利迪交叉的動力學。
用smFRET檢測霍利迪交叉(HJs)的實時構象變化2、單分子示蹤Nanoimager可以在兩個通道同時示蹤細胞或者純化物樣品中的單分子 (圖5)，并計算擴散系數。細胞中分子的擴散系數可以被示蹤，如酶或蛋白可以通過藥物和抗生素的反應來示蹤。低擴散率可以表示標記分子與另一分子或結構的相互作用或相結合。同時示蹤兩種標記了不同熒光分子的分子可以確定兩者動態(tài)相互作用的水平。Nanoimager可以直接反映純化樣品中熒光粒子的擴散率和預估大小，具有敏感性 (單熒光分子級別) 和特異性 (雙色標記可以顯著降低檢測雜質的可能性)。
Nanoimager雙色追蹤單分子/粒子3、使用Nanoimager成像—更大的視野Nanoimager的每個成像通道均有50 µm x 80 µm的大視野，而其他大部分單分子顯微設備只有20µm x 20 µm的視野。視野中照明均勻，可以實現(xiàn)單分子或細胞的高通量成像并快速收集數據。
下圖顯示了以10倍于其他技術的速度對突變的大腸桿菌細胞的不同表型進行成像。為了獲得不同表型的可靠的結果，需要對大量細胞進行比較。使用具有大視野，能夠自動對焦和自動獲取數據的Nanoimager可以顯著加快整個實驗速度和通量。將大視野與超分辨成像結合是Nanoimager的獨特優(yōu)勢。
Nanoimager的大視野可以在高分辨率下實現(xiàn)高通量成像規(guī)格及參數：
1、數據獲取分析：
分 辨 率成像總數視 野獲取速度3D成 像成像速度橫向分辨率<20nm；縱向分辨率<50nm最多可配置4激光每個通道50μm×80μm100fps/幀像散成像數秒～數分鐘2、操作參數：
聚焦模式
穩(wěn) 定 性
照射模式
溫度控制
環(huán)境監(jiān)控單次自動對焦/連續(xù)自動聚焦<1 μm/K的漂移；<1 nm (1 Hz to 500 Hz)振幅TRIF /HILO自動補償陣列傳感器3、硬件參數：
規(guī) 格相 機物 鏡激 光 器激光類型樣 品 臺工 作 站21 cm x 21 cm x 15 cm最新sCMOS油鏡 NA=1.4～1.49紫色: 405 nm (150 mW)藍色: 473 nm (300 or 1000 mW), 488 nm (200 mW)綠色: 532 nm (300 or 1000 mW), 561 nm (200 or 300mW)紅色: 640 nm (300 or 1000 mW)近紅外: 730 nm (300 or 1000 mW)DPSS 和二極管20/20/10 mm XYZ移動范圍，1 nm精度的閉合壓電平臺內存＞32GB，顯卡GeForce GTX 1080/m
